動物疫病血凝分析儀執行標準

DY-7000動物疫病血凝分析儀廣泛適用于動物疫病預防控制中心、動物防疫監督所、獸醫藥品監察所、獸醫研究所、大學、疫苗生產和大中型飼養企業等單位。
DY-7000動物疫病血凝分析儀是國內*根據國標中重大疫病免疫監測方法研制的高新設備，配套使用自動血凝分析管理軟件，能自動監測常見重大動物疫病的免疫抗體效價，及時掌握動物疫病流行規律和疫情動態，建立動物免疫效果監測記錄檔案。系統當前監測項目有：豬瘟抗體正向間接血凝檢測、口蹄疫抗體正向間接血凝檢測、高致病性禽流感H5亞型抗體血凝抑制檢測、高致病性禽流感H7亞型抗體血凝抑制檢測、高致病性禽流感H9亞型抗體血凝抑制檢測、新城疫抗體血凝抑制檢測。

試驗方法：
1 血凝（HA）試驗
1） 在V型微量反應板的1～12孔均孔加入0.025ml PBS，換滴頭。
2） 吸取0.025ml血凝抗原加入*孔，混勻。
3） 從第1孔吸取0.025ml血凝抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025ml棄去，換滴頭。
4） 每孔再加0.025ml PBS。
5） 每孔均加入0.025ml 1%（V/V）雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）。
6） 將反應板在振蕩器上震蕩1～2分鐘或輕扣反應板混合反應物，在室溫（20～25℃）下靜置40分鐘后觀察結果，（如果環境溫度太高，可置4℃環境下），在對照孔紅細胞顯著呈鈕扣狀時判定結果。
7） 結果判定  將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。*血凝（不流淌）的抗原或病毒zui高稀釋倍數代表一個血凝單位（HAU）。
2  血凝抑制（HI）試驗
1） 根據HA試驗測定的效價，計算配制4個血凝單位(4HAU)抗原。以*血凝的病毒zui高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數。例如，HA效價為1:256，則4HAU抗原的稀釋倍數應是1:64（256除以4）。
2） 加稀釋液：
在微量反應板的第1～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。
3） 稀釋待檢血清：
取1號待檢血清0.025ml加入*排第1孔，充分混勻后吸0.025ml于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025ml棄去。
取2號待檢血清加入第2排；取3號待檢血清加入第3排……均按上法稀釋。
  注意！每取一份血清時，必須更換吸頭。
4） 稀釋陰性血清：
  在血凝板的第7排*孔加陰性血清0.025ml，對倍稀釋至第3孔，混勻后從該孔取出0.025ml棄去。
    5） 稀釋陽性血清：
  在血凝板的第8排第1孔加陽性血清0.025ml，對倍稀釋至第10孔，混勻后從該孔取出0.025ml棄去。
6） 第1～11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025ml，在室溫（20～25℃）下靜置30分鐘或2～8℃ 50分鐘。
7） 每孔加入0.025ml 1%（V/V）的雞紅細胞懸液，震蕩混勻，在室溫（20～25℃）下靜置20～30分鐘或2～8℃ 45～60分鐘，對照紅細胞將呈明顯鈕扣狀沉于孔底。
結果判定 
以*抑制4 HAU抗原的zui高血清稀釋倍數判為該血清的HI效價。
只有陰性對照孔血清滴度不大于2log2，陽性對照血清誤差不過1個滴度，試驗結果才有效。
禽流感滅活疫苗的免疫效果判定：家禽免疫后21天進行免疫效果監測。禽流感抗體血凝抑制（HI）抗體效價≥24判定為合格
存欄家禽抗體合格率達到≥70%判定為合格。
新城疫免疫效果監測：免疫21天后，進行免疫效果監測。抗體血凝抑制試驗抗體效價≥25判定為合格
存欄家禽抗體合格率達到≥70%判定為合格。

【注意事項】 
（1）HA和HI試驗影響因素甚多，應嚴格控制試驗條件。每加一試劑或樣品后需更換吸頭，同時應嚴格控制作用溫度和時間。
（2）準確配制紅細胞懸液，使用時應隨時振搖。
（3）用pH值7.0～7.2的PBS作為稀釋液。
（4）抗原和陰、陽性血清若有污染，應廢棄。
（5）準確配制4HAU抗原，使用前需進行滴定，滴定好的抗原應在2小時內用完。
（6）抗原和血清按規定保存。凍干試劑應按規定的體積用PBS溶解。溶解后2～8℃保存不過1個月；可分裝成小包裝，-70℃凍存，隨用隨取。切忌反復凍融。
（7）鴨、鵝以及哺乳動物的血清一般需進行非特異性凝集和抑制素的處理。
（8）同一亞型不同毒株的HI試驗抗原，若抗原性存在差異，則檢測同一血清的HI效價不同。
（9）在使用微量加樣器時，槍頭進入試劑瓶面下約2~3ml深處，不可過深。待槍頭撤出液面后斜貼在試劑瓶的瓶壁上，淌走多余的液體，防止形成液滴滴入凝集板孔中。
（10）雞紅細胞懸液是現配現用，剩余的放于4℃保存，如果出現溶血現象則不能使用。
（11）每次檢測可只做一份陰陽性血清對照試驗。
（12）試驗完成后立即上機判讀，否則易出現紅細胞下滑現象。
（13）凍干對照血清和抗原存放于-20℃，溶解過后存放于4℃。